关于“亚细胞定位”伯小远在前面已经推出了好几期的文章，但仍有童鞋觉得不敷，不敷咋办呢？那就继续摆设咯~谁让伯小远是个宠粉狂魔呢！
亚细胞定位的重要性在前面的文章中已经讲过了，那里就不再多讲，我们只要记住，研究卵白的亚细胞定位关于研究基因的功用、卵白互做及其感化机理长短常有需要的就能够了。本期的文章不讲太多原理性的工具，次要为各人展现定位在差别的亚细胞构造的图片详细长什么样子，不要问伯小远为什么要大费精神去搜集那些工具，等你看完下面的内容就会大白，而且还会感激伯小远哦！1.研究亚细胞定位的一套办法
研究一个未知基因的卵白亚细胞定位时，一般能够先用生物信息学的办法预测该基因的亚细胞定位（下表给出了一些预测亚细胞定位成果的网站（表1）），但绝大大都的预测法式算法是有必然局限的，其预测数据一般只能做为参考，详细的定位还得以现实的尝试成果为准。表1 卵白量亚细胞定位的部门预测软件和网站(Donnes and Hoglund, 2004)。
目前动物卵白量的亚细胞定位办法中应用较遍及的是借助于陈述基因表达产品来实现目的卵白定位的交融陈述基因定位法，此中绿色荧光卵白应用最为普遍。该办法一般需要借助一些已知定位的卵白marker做为参照，从而判断出未知基因的定位情况。那么卵白marker怎么选？在现实的操做过程中一般先零丁对目标基因停止与尝试，按照预尝试的成果判断其可能的定位，然后再选择对应的卵白marker停止共转，进一步验证其亚细胞定位。单看那句话似乎很简单，但若是你关于差别的亚细胞构造长啥样都不清晰，又若何按照预尝试成果选择对应的卵白marker呢？为领会决那个问题，伯小远先带你回忆一下根底的常识！
2.动物细胞构造
下面是一张动物细胞的亚显微构造图（图1），我们研究的目标基因可能定位在此中任何一个亚细胞构造上，因而先记清晰那些构造，然后和伯小远一路去文献里面看看定位在差别的亚细胞构造上的图片都长什么样吧！图1 动物细胞的亚显微构造。3.各亚细胞构造的定位情况
下面讲到的亚细胞定位，其用到的办法根本都是交融陈述基因定位法，通过瞬转烟草叶片或原生量体在共聚焦显微镜下摄影察看到的成果。
3.1定位在细胞量
我们起首看一看定位在细胞量详细长什么样子，下面是一篇文献，该文献讲到，在35S启动子的驱动下，将AtHSBP交融到GFP的N端（AtHSBP-GFP），并在野生型拟南芥叶肉原生量体中停止阐发，以评估热休克反响（HSR）期间的亚细胞定位情况（图2）。原生量体在不停止热休克（HS）处置（CK）的情况下，或在37℃时用HS处置1h（H1R0），然后从HS处置后恢复1h（H1R1）或2h（H1R2）以衰减热休克反响（HSR）。在一般情况下，AtHSBP-GFP次要在细胞量中（CK）中表达。而H1R0处置后，在细胞核内也能够察看到微弱的GFP信号。在H1R1恢复期间，AtHSBP-GFP转移到细胞核中，然而，在H1R2恢复期间，无法检测到审定位的GFP信号。那些数据表白AtHSBP在热胁迫下可由细胞量定位易位到细胞核中。图2 AtHSBP在拟南芥叶肉原生量体中的瞬时表达(Hsu et al.,2010)。AtHSBP在叶肉原生量体中的瞬时表达。用AtHSBP-GFP转染野生型拟南芥原生量体，不经HS（CK）或在37℃时HS处置1h（H1R0），从HS处置后恢复1h（H1R1）或2h（H1R2）。用共聚焦显微镜察看GFP信号。蓝色暗示4,6二脒基-2-苯吲哚盐酸（DAPI）染色的细胞核，红色暗示叶绿体的自觉荧光。
从那个例子我们能够看出，若一个基因定位在细胞量中，在一些情况下我们是能够看到充满整个原生量体的GFP信号的（如图2 CK，因为该目标基因其实不定位在叶绿体中，因而存在一些被叶绿体遮挡的空缺）；别的，因为动物细胞一般都存在大液泡，液泡的存在往往会将细胞量挤压到紧挨细胞膜的位置，那个时候我们其实不能看到充满整个原生量体的GFP信号，就好比下面那个例子（图3），35S驱动GFP在烟草原生量体中的瞬时表达，理论上应该是任何亚细胞器中都存在GFP信号，但是图3i中却存在很大一个空缺没有荧光信号，那个空缺的部门可能就是液泡，那个时候细胞量中的荧光信号就是紧挨细胞膜的，若是碰到那种情况，就需要通过marker来区分出到底是定位在细胞量仍是定位在细胞膜中，又或者是细胞膜和细胞量中都有信号。图3 35S-GFP在烟草原生量体中的表达(Liu et al., 2020)。3.2定位在液泡
在一篇文献中，做者为了验证GmVTL1a的亚细胞定位，将GFP交融在基因的ORF的N端，并通过瞬时转化烟草原生量体停止察看，有趣的是，GFP卵白的荧光信号仅在照顾GFP-GmVTL1a转基因的烟草原生量体的液泡膜上察看到（图4a-h），那很容易与叶绿体（ChlorophyII）、细胞膜标识表记标帜物FM4-64FX的信号区分隔来。图4 GmVTL1a在烟草原生量体中的亚细胞定位(Liu et al., 2020)。（a，e）绿色暗示GFP信号。（b）粉色暗示叶绿体本身荧光。（f）红色暗示细胞膜标识表记标帜物FM4-64FX。（c，g）灰色显示明场。（d，h）合并后的图像显示了合并后的三个通道。
注：那里做者证明目标基因定位在液泡膜上并非间接证明的，而是通过和细胞膜标识表记标帜物FM4-64FX不重合间接证明的，各人在以后的进修中如果碰到不克不及间接证明的，也能够进修那种间接证明的办法哦！3.3定位在叶绿体
上面的例子用到的办法都是瞬时转化原生量体对目标基因的亚细胞定位停止察看，而且都给出了叶绿体自觉荧光的照片，想必各人都已经晓得在原生量体中叶绿体长什么样子了，那么在烟草叶片中叶绿体味是什么样子呢？请跟伯小远一路看看下面的例子吧。从图5中能够看到用于检测PnToxA叶绿体定位的序列ToxA62-132交融GFP之后其亚细胞定位与叶绿体标识表记标帜RUB1sp-mCherry的荧光在叠加图中完全重合，因而申明ToxA62-132-GFP定位在叶绿体中。图5 用于检测PnToxA叶绿体定位的序列的亚细胞定位(Sperschneider et al., 2017)。共聚焦图像显示了ToxA62-132-GFP在本氏烟细胞中的叶绿体定位。左图显示叠加了ToxA62-132-GFP和RUB1sp-mCherry荧光的透射光图像。中间的图显示RUB1sp-mCherry荧光（叶绿体标识表记标帜物），而右边的图显示ToxA62-132-GFP荧光。
若是我们察看到的荧光呈点状，而且与叶绿体的marker重合，那么我们能够考虑一下其亚细胞定位能否定位在内囊体或者量体上（图6）。图6 表达PGTG_00164-YFP（a）或PGTG_06076-YFP（b）的细胞显示叶绿体点状定位，提醒其定位可能是类囊体或量体(Sperschneider et al., 2017)。
3.4定位在内量网
内量网，光听那个名字就晓得其外形应该和“网”脱不了关系，通过尝试证明定位在内量网中的外形确实也都是网状的，下面给出了两个在烟草叶片细胞中定位在内量网中的图片（图7，图8）。图7 拟南芥细胞团结素受体AHK3定位于瞬时转化的烟草叶片细胞和拟南芥幼苗的内量网(Caesar et al., 2011)。（A-D）35S启动子或UBQ10启动子驱动AHK3与内量网标识表记标帜ER-rk CD3-959的烟草叶表皮细胞中共表达的共聚焦图像。
图8 RTP1-GFP的亚细胞定位。RTP1-GFP或Free-GFP在烟草叶片中瞬时表达，并在共聚焦显微镜下察看荧光。RTP1:GFP交融卵白定位于烟草表皮细胞的内量网（ER）。Free GFP做为对照。ER标识表记标帜为红色荧光，GFP荧光为绿色。Overlay是绿色荧光和红色荧光的叠加图。
3.5定位在细胞核
我们都晓得转录因子一般定位在细胞核中，下面那个例子就是参与拟南芥防御信号通路的关键转录因子AtWRKY29，在一种南极开花动物南极漆姑草原生量体中的亚细胞定位情况，能够看出其亚细胞定位仅定位于细胞核中（图9b）。图9 AtWRKY29在南极漆姑草原生量体中的亚细胞定位(Cha et al., 2019)。（a）35-GFP；（b）AtWRKY29-GFP。
3.6定位在核膜
定位在核膜，动物中我们一般比力少见，而人类的许多稀有疾病，如肌肉萎缩、视神经萎缩和早衰症，都与核膜成分的突变亲近相关，动物在核膜那一方面研究的比力少，今天我们就只看看定位在核膜上的亚细胞定位图片。下面的基因PNET7就是定位在核膜上的一个例子（图10）。图10 YFP标识表记标帜的PNET7在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位成果(Tang et al., 2020)。红色荧光代表细胞核。
3.7定位在核仁
良多时候我们都只存眷一个基因能否定位于细胞核，没想到下面那个例子还专门把核仁零丁拿出来研究了，此中PGTG_13278-YFP固然定位于细胞核，但其实不定位于细胞核中的核仁，而PGTG_15899-YFP不只定位于细胞核也定位于核仁中，至于为什么，各人若是感兴趣，能够去看一下那篇文献喔！图11 表达PGTG_13278-YFP的细胞表示为细胞审定位但排除核仁（a），表达PGTG_15899-YFP的细胞表示为细胞核和核仁定位（b）(Sperschneider et al., 2017)。
3.8多种亚细胞构造定位集锦
剩下的细胞器有一篇文献做的很全面，做者将一些细胞器的marker别离在水稻原生量体以及稳转水稻的叶片和根中停止了察看，因而那里就不再像上面一样详细地介绍了，各人能够看看下面两张图，一些还没来得及介绍的细胞器根本都在里面，此中也包罗一些上面已经介绍过的，但无妨碍各人再看一遍，因为有时候用到的转化受体纷歧样，其形态可能也存在差别，好了，我们一路去看看吧！图12 绿色荧光卵白（GFP）和GFP交融细胞器标识表记标帜物在水稻原生量体中的亚细胞定位(Wu et al., 2015)。（A）GFP在细胞量中的表达。（B）内量网（ER）标识表记标帜SPAmy8-GFP-KDEL。（C）线粒体标识表记标帜NRPS10-GFP。（D）量粒CD3-963包罗高尔基体标识表记标帜。（E）量粒CD3-971包罗液泡标识表记标帜。（F）细胞核标识表记标帜OsRH36-GFP。（G）过氧化物酶体标识表记标帜GFP-KSRM和（H）量膜标识表记标帜OsRPK1-GFP。
图13 在转基因水稻植株中，针对差别细胞器的GFP或GFP交融细胞器标识表记标帜物的亚细胞定位(Wu et al., 2015)。操纵共聚焦显微镜在转基因水稻幼苗的叶片（左图）和根（右图）组织中显示GFP荧光。（A）GFP在细胞量中的表达。（B）内量网（ER）标识表记标帜SPAmy8-GFP-KDEL。（C）线粒体标识表记标帜NRPS10-GFP。（D）量粒CD3-963包罗高尔基体标识表记标帜。（E）量粒CD3-971包罗液泡标识表记标帜。（F）细胞核标识表记标帜OsRH36-GFP。（G）过氧化物酶体标识表记标帜GFP-KSRM和（H）量膜标识表记标帜OsRPK1-GFP。
3.9一些特殊的亚细胞构造定位
3.9.1定位在细胞骨架
细胞骨架一般是指细胞量中由卵白量构成的纤维网格构造。它是一个动态构造，此中有一部门不竭的被毁坏，更新或新建，有些细胞能够通过骨架的毁坏和重塑运动。下面给出了两个定位在细胞骨架中的例子，不认真看很容易与内量网的定位混淆，正好伯小远找到了一个例子，同时给出了那两种亚细胞构造的定位情况，帮忙你区分，实是贴心如我，哈哈！别的在此中一个例子中还给出了一些其它的细胞构造，买一送二，很赚有木有！
下面给出的那个例子不只给出了细胞骨架的定位，还给出了肌动卵白丝和微管的定位。各人能够本身对照区分一下哦！
图14 AtOFP1与细胞骨架有关(Hackbusch et al.,2005)。操纵激光共聚焦显微镜对瞬时表达的GFP交融卵白在本氏烟叶片中的定位停止了阐发。（a）AtOFP1-GFP储蓄积累在核仁中，且定位于细胞骨架。（b）肌动卵白解聚药物cytochalasin D处置20分钟后，AtOFP1-GFP的定位没有改动。（c）Talin的I/LWEQ构造域交融GFP定位于肌动卵白丝。（d）MAP3-GFP与微管相关。
下面那个例子中的a（图15a）定位于内量网，b（图15b）则定位于细胞骨架，两张图片都很明晰标致。按照图注各人能够发现那两个其实都是一件工具，各人有兴趣能够去研究一下那篇文献，那篇文献次要是关于亚细胞定位、非靶向运输以及胞间连丝之间的一些研究，那里就不详细解释了。
图15 TMV P30-rsGFP的靶向运输(Crawford et al., 2000)。P30-rsGFP定位于整个细胞和细胞壁的离散亚细胞位点。（a）共聚焦显微镜图像显示P30-rsGFP定位于内量网ER，（b）P30-rsGFP在细胞骨架中的定位，（c）P30-rsGFP定位于转染细胞的细胞量，并位于挪动的细胞的细胞壁上（黑点状）。（d）P30-rsGFP细胞聚焦，该卵白次要定位于胞间连丝的细胞壁点状处。
3.9.2 定位于肌动卵白丝
其其实上面的“买一送二”中已经看过肌动卵白丝的定位了，那里伯小远还想给各人一个高清放大的图看一看（图16c），加深各人的印象！
图16 亚细胞定位决定了卵白在胞间连丝运输中的可用性(Crawford et al., 2000)。（a）ER-GFP定位于内量网腔，不克不及通过胞间连丝。（b）GFP-mTn定位于肌动卵白丝，是细胞自主的。（c）转染GFP-mTn的细胞的高倍放大图，图中显示肌动卵白丝。（d）NLS-rsGFP定位于细胞核，但也会转移到临近细胞。转染后的细胞在细胞核、细胞膜和内量网ER中均含有NLS-rsGFP，而在临近细胞中仅在细胞核中检测到NLS-rsGFP。（e）NLS-rsGFP从转染细胞转入临近的12个细胞。（f）NLS-2×rsGFP在转染细胞中保留。
3.10核糖体和细胞壁定位的问题
最初给各人解释一下为什么没有给出定位在核糖体和细胞壁的图片，原因是那两个亚细胞构造伯小远没有找到比力好的相关文献，各人对那方面若是比力领会能够与伯小远互动哦！关于核糖体伯小远找到良多核糖体卵白相关的基因，做者研究的都是核糖体之外的功用，其定位有的在细胞核，有的在细胞量，伯小远料想可能是核糖体的功用（合成卵白量）已经很清晰了，所以各人研究的都是核糖体之外的功用；而关于细胞壁，一般是通过烟草叶片或者洋葱表皮瞬时表达目标基因，通过量壁别离的办法来区分到底是定位在细胞膜仍是细胞壁上。在那里伯小远别离找了通过洋葱表皮细胞和烟草叶片瞬时表达目标基因的例子，比力高兴的是烟草叶片阿谁例子量壁别离之后在细胞壁上也有荧光，只不外是呈点状散布的，但是不管咋样伯小远仍是找到了，只是没有找到那种完好定位于细胞壁上的例子！
在一篇文献中，做者起首证了然GTPases定位在细胞膜中，为了进一步验证GTPases的细胞膜定位，做者在高浓度NaCl溶液处置下诱导表达GFP CA-OsRac3和GFP CA-OsRac6的洋葱表皮细胞停止量壁别离。成果显示，在细胞量和细胞核中都发现了对照GFP（图17，左）。同样，GFP CA-OsRac6在细胞量、细胞核以及量壁别离后的细胞膜中均可见（图17，中间）。相反，GFP CA-OsRac3只在细胞膜中检测到，而且在量壁别离后随细胞膜收缩（图17，右）。
图17 0.5M NaCl溶液诱导洋葱表皮细胞中瞬时表达的GFP-OsRac3（右）和GFP-OsRac6（中间）的量壁别离阐发(Chen et al., 2010)。35S-GFP（左）做为对照。
那个例子做者操纵农杆菌介导的瞬时检测办法确定RBSDV P7-1的亚细胞定位。在CaMV 35S启动子的控造下，P7-1交融到加强绿色荧光卵白（eGFP）的N端，在本氏烟草细胞中瞬时表达。打针后2天用共聚焦显微镜察看荧光。在表达P7-1:eGFP的表皮细胞中（图18A），细胞核、细胞量及细胞外周均有可见荧光，量浆裂解后的细胞沿细胞壁可见点状荧光。那种散布形式在表达对照35S:eGFP的细胞中没有发现，此中量膜荧光在量浆合成后从非荧光细胞壁别离出来。为了证明那必然位形式，做者将P7-1与黄色荧光卵白的N端交融，在烟草的表皮细胞中表达。如图18B所示，P7-1:YFP在细胞核、细胞量和细胞外周均可见荧光，并在量壁别离后的叶片细胞沿细胞壁构成点状散布，而在表达35S:YFP的表皮细胞细胞壁未见荧光。那些成果表白P7-1与细胞壁有关。
图18 P7-1在本氏烟叶片细胞中的亚细胞定位。（A）35:eGFP（左）和P7-1:eGFP（右）在未量壁别离（上图）或量壁别离（下图）的本氏烟叶片细胞中的定位。放大区域显示P7- 1:eGFP的点状构造。（B）35:YFP（左）和P7-1:YFP（右）在未量壁别离（上）或量壁别离（下）烟草叶片细胞中的定位。放大的区域显示了P7-1:YFP的点状构造。白色和黑色箭头别离指向量壁别离后的细胞壁和量膜。
小远叨叨
看了以上差别基因定位在差别亚细胞器的荧光图片之后，想必各人对那些构造都有了一个大致的印象，有印象可不可，更好记住它们，如许当本身在研究一个新基因时，零丁对新基因做完亚细胞定位的预尝试之后，我们必然要尽可能准确地判断它的定位，然后选择适宜的marker与其停止共定位，进而得到我们所要研究基因的亚细胞定位成果。再回到文章开头，各人是不是应该感激一下伯小远呢！哈哈！最初，希望各人保藏本篇文章，没事拿出来多看一看，将那些差别的外形深深地刻在本身的脑海里，比及需要用的时候间接从大脑里面调取出来就能够啦！
References：
Caesar K, Thamm A M K, Witthöft J, et al. Evidence for the localization of the Arabidopsis cytokinin receptors AHK3 and AHK4 in the endoplasmic reticulum[J]. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(15): 5571-5580.
Cha O K, Lee J, Lee H S, et al. Optimized protoplast isolation and establishment of transient gene expression system for the Antarctic flowering plant Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2019, 138(3): 603-607.
Chen L, Shiotani K, Togashi T, et al. Analysis of the Rac/Rop small GTPase family in rice: expression, subcellular localization and role in disease resistance[J]. Plant and cell physiology, 2010, 51(4): 585-595.
Crawford K M, Zambryski P C. Subcellular localization determines the availability of non-targeted proteins to plasmodesmatal transport[J]. Current Biology, 2000, 10(17): 1032-1040.
Dönnes P, Höglund A. Predicting protein subcellular localization: past, present, and future[J]. Genomics, proteomics & bioinformatics, 2004, 2(4): 209-215.
Hackbusch J, Richter K, Müller J, et al. A central role of Arabidopsis thaliana ovate family proteins in networking and subcellular localization of 3-aa loop extension homeodomain proteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005, 102(13): 4908-4912.
Hsu S F, Lai H C, Jinn T L. Cytosol-localized heat shock factor-binding protein, AtHSBP, functions as a negative regulator of heat shock response by translocation to the nucleus and is required for seed development in Arabidopsis[J]. Plant physiology, 2010, 153(2): 773-784.
Liu S, Liao L L, Nie M M, et al. A VIT‐like transporter facilitates iron transport into nodule symbiosomes for nitrogen fixation in soybean[J]. New Phytologist, 2020, 226(5): 1413-1428.
Pan Q, Cui B, Deng F, et al. RTP 1 encodes a novel endoplasmic reticulum (ER)‐localized protein in Arabidopsis and negatively regulates resistance against biotrophic pathogens[J]. New Phytologist, 2016, 209(4): 1641-1654.
Sperschneider J, Catanzariti A M, DeBoer K, et al. LOCALIZER: subcellular localization prediction of both plant and effector proteins in the plant cell[J]. Scientific reports, 2017, 7(1): 1-14.
Sun Z, Zhang S, Xie L, et al. The secretory pathway and the actomyosin motility system are required for plasmodesmatal localization of the P7-1 of rice black-streaked dwarf virus[J]. Archives of virology, 2013, 158(5): 1055-1064.
Tang Y, Huang A, Gu Y. Global profiling of plant nuclear membrane proteome in Arabidopsis[J]. Nature Plants, 2020, 6(7): 838-847.
Wu T M, Lin K C, Liau W S, et al. A set of GFP-based organelle marker lines combined with DsRed-based gateway vectors for subcellular localization study in rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant molecular biology, 2016, 90(1-2): 107-115.
好文保举
【小远答疑】亚细胞定位常见问题亚细胞定位的爱恨情仇：核、量之争【干货】若何做卵白亚细胞定位尝试？新上线“伯小远答疑”栏目，求围不雅！来一场卵白与卵白间的“风花雪月”最强大脑炼成记——若何验证一个基因是转录因子茫茫“量”海，何认为家？——一种卵白在差别亚细胞器定位的原因伯远生物可供给以下手艺办事
载体构建
亚细胞定位