动脉粥样硬化中的免疫细胞包罗 T、B、NK 和 NKT 细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞。单细胞转录组测序（scRNA-seq）手艺的停顿使我们对免疫细胞亚群的认识愈加完美。比来的研究已经在人类动脉粥样硬化病变和 PBMC 样本中利用了免疫细胞的 scRNA-seq，研究证明了已知的细胞亚群，也识别出的新的免疫细胞亚群，判定出 HIV+患者的 PBMC 中显著上调基因。在那篇综述中，总结了 scRNA-seq 在动脉粥样硬化患者的斑块和 PBMC 中获得的最新数据。
【颁发期刊】Cardiovascular Research（IF: 14.919）
【发布时间】2021年11月
【影响因子】10.787
【颁发单元】美国加州拉霍亚免疫学研究所
1. 心血管疾病中的免疫细胞
心血管疾病仍然是世界范畴内的次要灭亡原因，仅次于癌症和 COVID-19。心血管疾病是一个普遍的术语，包罗中风、心肌梗死（MI）或外周动脉疾病。那篇综述存眷的是动脉粥样硬化，它是大大都心血管疾病的首恶祸首。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性动脉疾病，与血脂和低密度脂卵白（LDL）胆固醇升高有关。固然高胆固醇血症是疾病发作的需要前提，但免疫机造在病变的开展、停顿和易感性中起着关键感化。【1】易损性是指病变有分裂或侵蚀的倾向，那与斑块帽厚度和免疫细胞含量有关。【2】
2017年，Canakinumab Antiinflammatory Thrombosis Outcome Study（CANTOS）初次证明，通过按捺炎症反响能够降低动脉粥样硬化心血管事务的风险。【3】在 CANTOS 中，一种靶向白介素 IL-1β 的单克隆抗体（canakinumab）被用于有 MI 病史和残留炎症风险的患者。承受 canakinumab 的患者履历动脉粥样硬化心血管事务的相对风险降低了15%，同时血液 hsCRP 和 IL-6 显著降低。重要的是，血脂，包罗 LDL 胆固醇，不受抗 IL-1β 治疗的影响，强调了 canakinumab 的特异性抗炎感化。那项研究为寻找更有效、更有针对性和更平安的治疗动脉粥样硬化中残存炎症风险铺平了道路。
2. 动脉粥样硬化免疫细胞的异量性
对动脉粥样硬化病变中免疫细胞异量性的研究始于20世纪80年代的免疫染色，其时能够对两种标识表记标帜物停止染色。组织中的免疫染色比来被细化到能够分辩大约16种标识表记标帜物。流式细胞术于2006年被引入动脉粥样硬化的研究，标记物的范畴得到扩展。跟着手艺开展，细胞量谱（CyTOF）能够检测大约40个标识表记标帜。本文聚焦目前可用的更高分辩率的办法：单细胞转录组测序（scRNA-seq）、单细胞外表卵白测序（多达200个抗体）、单细胞免疫组库。
3.人类动脉粥样硬化病变的单细胞转录组测序
以下汇总了动脉粥样硬化患者的斑块和/或 PBMC 中免疫细胞的 scRNA-seq 数据。【17-20】图1显示了动脉粥样硬化动脉中小鼠和人髓系细胞在统一 UMAP 中的整合。那三项研究【17, 18, 20】的次要目的是将 scRNA-seq 特征与心血管事务联络起来。一项研究【20】聚焦于发现白细胞亚群异量性及其转录组特征。三项研究集中在免疫细胞亚群，而 Wirka 等【18】次要涉及光滑肌细胞（SMC）表型。表1概述了那些研究的手艺比力。近年来，从血管平分离免疫细胞的手艺挑战包罗酶消化、双细胞、灭亡细胞、细胞应激、批次效应等。【26-30】 酶促的组织消化和机械的组织合成可能招致某些细胞类型的不平均丧失，那可能解释了在整个研究中察看到的可变性。T 细胞比体积大而懦弱的巨噬细胞或树突状细胞更能在别离过程中存活下来。酶消化过程中的细胞应激反响会影响研究成果。scRNA-seq 次要产生高表达基因，系统缺失低表达基因。因为消化法式、样本类型和样本搜集方面的差别，以及尝试差别，对那些研究停止间接比力具有挑战性。人动脉粥样硬化动脉次要免疫细胞亚群的关键标识表记标帜基因如图2所示。
图1 动脉粥样硬化动脉中的人和小鼠髓系细胞图2 人类动脉粥样硬化动脉次要免疫细胞亚群的关键标识表记标帜基因表1人类 scRNA-seq 研究的手艺信息
人类斑块 scRNA-seq 的根底文章【17】阐发了通过颈动脉内膜剥脱术获得的人类斑块和婚配的 PBMC 中的白细胞。颈动脉内膜剥脱术样本含有斑块、纤维帽，有时也有颈动脉中层的一部门，但没有外膜。用 10x Genomics 3’ scRNA-seq 结合外表抗体阐发了来自统一患者的 PBMC（1654个细胞）和颈动脉内膜剥脱术样本（254个细胞）。别的4例无症状和2例有症状的颈动脉内膜剥脱术样本接纳3’ scRNA-seq 停止阐发。
做者在斑块和血液中发现了16个 T 细胞群（表2）。出人意料的是，CD8+ T 细胞次要在斑块(46%)中富集。血液 T 细胞转录组次要富集静息 CD4+T 细胞，表达按捺 T 细胞功用的基因（KLF2和TXNIP）。斑块 T 细胞表达的基因与 T 细胞活化（NFATC2，FYN，ZAP70）、细胞毒性（GZMA，GZMK）和 T 细胞衰竭（EOMES，PDCD1，LAG3）相关。斑块 CD4+T 细胞处于激活的促炎形态。
表2人 scRNA-seq 检测的免疫细胞亚群
固然外表抗体检测只在一个斑块样本中利用，但它识别出5个差别的巨噬细胞亚群。Cluster 1表达了参与巨噬细胞激活的基因（HLA-DRA和CD74）。Cluster 2高度炎症，表达的基因参与炎症反响（CYBA，LYZ，S100A9/8，AIF1），Toll 样受体连系（S100A9/8），氧化复原酶活性（CYBA）和金属卵白酶按捺（IMP1）。cluster3 中上调的基因参与促炎症反（JUNB,NFKBIA），高表达MALAT1。那些细胞群可能与小鼠动脉粥样硬化中发现的炎性巨噬细胞相关（图1）【16】。Cluster 5 表达的基因参与胆固醇摄取和代谢（APOC1,APOE）和脂量积累（PLIN2），类似于小鼠动脉粥样硬化中的TREM2泡沫细胞。【16】那些巨噬细胞显示出促炎信号削弱（IL-1, IFN），那与泡沫细胞的抗炎性量一致。共46个样本（29个来自无症状患者，17个来自有症状患者）停止了细胞量谱检测【13，14】，仅获得2个可区分的巨噬细胞亚群。在 CyTOF 中利用和挑选的标识表记标帜的数量，虽然供给了信息，但比在 scRNA-seq 中要少，那招致了免疫细胞亚群的分辩率较低。Vallejo【20】等在32个样本上利用了40种寡核苷酸标识表记标帜的抗体，从而将类似于 CyTOF 的切确细胞外表表型与转录组连系起来。
Wirka等【18】利用了从移植心脏别离的人冠状动脉细胞。与颈动脉内膜剥脱术样本差别，那些样本包罗外膜细胞。那项研究次要集中在 SMCs 和成纤维细胞样细胞（fibromyocyte），但那里只回忆了发现的免疫细胞亚群（巨噬细胞、T 细胞、B 细胞和 NK 细胞）。做者利用了 10x Genomics 平台和 PE150 测序。过滤少于500个基因的细胞和少于5个细胞表达的基因。通过丢弃含有超越3500个基因的细胞，能够削减双细胞。线粒体基因含量在7.5%以上的细胞被认为是死细胞。做者判定了7个免疫细胞群：表达RNASE1、C1QA、C1QC、C1QB和CD14的巨噬细胞；表达IL32、TRAC、IL7R、CCL5和CD3D的 T 细胞；表达CD79A、CD37、MS4A1、LTB、CD52的 B 细胞；表达IGHM、JCHAIN、IGLC3、IGHV3-73、MZB1的IgM浆细胞；表达IGHG2、IGHGP、MZB1、DERL3的IgG浆细胞；表达NKG7、GNLY、PRF1、GZMB、CCL5的 NK 细胞；表达TPSAB1、CPA3、C1orf186、SLC18A2、MS4A2的肥大细胞。
关于人类斑块 scRNA-seq 的第三篇文章颁发于2020年12月。斑块来自于颈动脉内膜剥脱术，14名男性和4名女性。Depuydt 等【19】利用 CD3、CD68、CD34 和抗 SMC 抗体对三个婚配的样本停止免疫组化阐发。在那四种抗体范畴内，免疫荧光数据与 scRNA-seq 数据一致。CEL-Seq2 手艺供给的转录组深度比 10× Genomic 手艺要深得多，但成本高得多，捕捉的细胞也少得多。做者着重研究了斑块中差别细胞类型的特异性基因或与冠状动脉疾病相关的基因。在确定的11个免疫细胞群中，5个是淋巴细胞群，5个是髓细胞群，1个无法确定。共利用7种差别的抗体（CD45-PECy7、CD3-BV421、CD4-PETR、CD28-BV650、Granzyme B-PE、TruStain Fcx 和 Fixable Viability Dye-eFluor 780）将细胞分选到孔中。
做者发现了 CD4+T 细胞的五个亚群（图2）。两个亚群具有细胞毒性，此中一个亚群表达PRF1、GZMA 和GZMK，但很少表达CD28，那表白那些细胞可能是 CD4+ CD28null39，另一个亚群表达GZMA、GZMK和CD28。CD4+ 初始 T 细胞的一个亚群表达IL7R、LEF1和SELL。通过FoxP3、IL2RA和CTLA4判定出 CD4+ 调理性 T 细胞；CD4+ 中心记忆 T 细胞表达LEF1、IL7R和SELL。CD8+T细胞的三个亚群中，GZMK+效应记忆T细胞表达GZMK，GZMA和CD69；末末分化细胞毒性 CD8+ T 细胞亚群表达GZMB，TBX21，NKG7，GNLY，ZNF683和CX3CR1，缺乏CD69；CD8+中央记忆 T 细胞表达LEF1，SELL，IL7R和LTB。
在最后的聚类中，Depuydt 等【19】发现了5个髓系细胞群：由HDC、KIT、CMA1、TPSAB1判定的肥大细胞群和4个表达CD14和CD68的细胞群。那四个群进一步细分，获得五种差别的巨噬细胞。2个炎性巨噬细胞亚群别离表达IL1B、CASP1、CASP4、KLF4和KLF4、IL1B、TLR4、ABCA1、TNF、IL18、CD9，别离定名为 IL1B+和 TNF+炎性巨噬细胞。ABCG1+泡沫巨噬细胞表达ABCA1、ABCG1、MMP9、OLR1、TREM2、CD9、ACTA2、LGALS3、CD68、IL18和CD9。CD1c+树突状细胞亚群表达CD1c、CLEC10A和FCER1A。
与 Fernandez【17】和 Winkels【14】等人的研究一样，T 细胞占阐发细胞的大大都（52%），而髓系细胞仅占19%。对 Winkels 小鼠数据【14】和其他8个小鼠数据【16】的荟萃阐发表白，T细胞的富集是因为髓系细胞的缺失，很可能是由样品消化过程引起的。巨噬细胞不如圆形淋巴细胞耐消化处置，因而，Fernandez【17】和 Depuydt【19】等人发现的髓系细胞的比例低，巨噬细胞会优先缺失。此外，颈动脉内膜剥脱术样本缺乏大部门中膜和所有外膜，而那些恰是巨噬细胞存在的处所。
比来的关于动脉粥样硬化的 scRNA-seq 研究【20】是对31名女性受试者的 PBMC 样本停止的，此中16人有亚临床动脉粥样硬化，由颈动脉超声确定。在31名被研究的女性中，有24人照顾艾滋病毒，大大都人的病毒载量无法检测到。该研究利用 BD Rhapsody 检测485个基因和40个抗体。总共获得了32000个细胞，判定出58个差别的亚群，包罗CD4+T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞、NK 细胞和单核细胞。为了检测心血管疾病的变革，他们阐发了患有和不患有心血管疾病的受试者之间的基因变革。所有那些受试者都是 HIV 阳性。
在 CD4+ 效应记忆 T 细胞中，CVD 组IL-32显著升高。IL-32 是一种炎症细胞因子，已知在心血管疾病中起重要感化。在 CD4+初始 T 细胞中，IL-32、SELL、SELPLG和CCR7在 CVD 组中也显著增加。此中一个 CD4+效应记忆 T 细胞显示TRAIL的显著上调。在 CD8+ 末末分化记忆T细胞，IL32在 CVD 女性患者中较高，在 CD8+初始 T 细胞群中也是如斯。在一个 EMRA CD8+T 细胞群中，CD52、TRAC和HOPX在 CVD 组显著上调，一些杀伤细胞凝固素受体（KLRC4、KLRD1、KLRG1 和KLRK1）也在 CVD 组上调。趋化因子 CCL5 及其次要受体 CCR5 参与动脉粥样硬化、心肌梗死的开展。CCL5 编码趋化因子 RANTES，已知在动脉粥样硬化中起重要感化。CCL5 或其受体在动物模子中有助于削减新内膜构成，巨噬细胞浸润以及动脉粥样硬化斑块的构成。在一些研究中，CCL5 也被用做可能的 CVD 生物标记物。最初，在 CD8+效应记忆 T 细胞中，CVD 与IL32、TRAC、HOPX、CCL5和杀伤凝固素受体KLRK1、KLRC4、KLRD1显著升高相关。
在一个典型单核细胞群中，CVD 与CCL4、SLC2A3、SOD2和SELPLG显著增加相关。在另一个典范单核细胞群中，TNF、DUSP1、TRAIL、APRIL和BAFF与 CVD 高度相关。CCL3、CCL4、IL1B、TLR2和DUSP2，已知与动脉粥样硬化相关，在CVD组的第三个典范单核细胞群高度上调。
4.总结
在没有外表标识表记标帜物的情况下，利用 scRNA-seq 转录组来区分 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞仍然具有挑战性。细胞外表表型信息的添加大大进步了免疫细胞的识别， Fernandez 等人【17】（21个寡核苷酸标识表记标帜抗体）和 Vallejo 等人【20】（40个寡核苷酸标识表记标帜抗体）论述了那项手艺的力量。如今，多达 200 种抗体可用于人类和小鼠细胞，与 scRNA-seq 连系，将进步免疫细胞亚群的分辩率，并增加发现新细胞亚群的时机。为了研究动脉粥样硬化特征基因，必需包罗安康对照，那在基于内膜切除术的研究中是不成能的，但能够利用 PBMC 和移植心脏的非动脉粥样硬化冠状动脉。scRNA-seq 连系细胞外表表型将进步人类动脉粥样硬化免疫细胞图谱的分辩率和量量。
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