现代生物手艺均通细致胞做为载体来停止，无论是基因治疗、干细胞、克隆手艺 都在细胞内停止的。细胞的生长需要必然的营养情况，用于庇护细胞生长的营养基量称为培育提拔基，即指所有用于各类目标的体外培育提拔、保留细胞用的物量，就其 本意上讲为人工模仿体内生长的营养情况， 使细胞在此情况中有生长和繁育的能 力。它是供给细胞营养和促进细胞生长增殖的物量根底。细胞培育提拔基其构成成分 次要有： 氨基酸、 水、 维生素、 碳水化合物、 无机离子及其他一些进核酸降解物、 激素等。 跟着动物细胞大规模培育提拔手艺的敏捷开展， 做为细胞培育提拔范畴中最根本的原料－ 细胞培育提拔基的用量也敏捷增加， 被普遍利用于细胞生物学科和医学研究的各个领 域，如疫苗消费（人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等，兽用 疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等） ，基因药物消费（如 EPO、TPA 等） ，临床用单 抗（如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3）等。
第一节 水与平衡盐溶液
1、培育提拔用水:体外培育提拔的细胞对水量特殊灵敏，对水的纯度要求较高。培育提拔用水 中假设含有一些杂量，即便含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，以至导 致细胞灭亡。用金属蒸馏器造备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不做 为培育提拔用水。 配造培育提拔用液应利用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水 净扮装置造备的超纯水。更好用龙头瓶储存，存放时间一般不该超越 2 周。 2、缓冲溶液、心理盐水、平衡盐溶液：稍后介绍。
第二节 细胞培育提拔基的根本要求
体外培育提拔的细胞间接生活在培育提拔基中，因而培育提拔基应能称心细胞对营养成分、促 生长因子、激素、渗入压、pH 等诸多方面的要求。
一、营养成分
庇护细胞生长的营养前提一般包罗以下几个方面：
1、氨基酸：是细胞合成卵白量的原料。所有细胞都需要 12 种必需氨基酸：缬氨 酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要 谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要感化，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成 的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的根本物量。 体外培育提拔的各 种培育提拔基内都含有必须氨基酸。
2、单糖：培育提拔中的细胞能够停止有氧与无氧酵解，六碳糖是次要能源。此外六 碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收才能更高， 半乳糖更低。 体外培育提拔动物细胞时， 几乎所有的培育提拔基或培育提拔液中都以葡萄糖做为必含的能源 物量。
3、维生素：次要饰演辅酶、辅基的角色，必不成少。生物素、叶酸、烟酰胺、 泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素 B12 都是培育提拔基常有的成分。
4、无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等根本元素， 还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
二、促生长因子及激素 已证明：各类激素、生长因子关于庇护细胞的功用、保 持细胞的形态（分化或未分化）具有非常重要的感化。有些激素对许多细胞生长 有促生长感化，如胰岛素，它能促进细胞操纵葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一 类细胞有明显促进感化，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳 腺上皮细胞生长感化等。
三、渗入压 细胞必需生活在等渗情况中，大大都培育提拔细胞对渗入压有必然耐受 性。人血浆渗入压 290mOsm/kg, 可视为培育提拔人体细胞的抱负渗入压。鼠细胞渗入压在 320mOsm/kg 摆布。 关于大大都哺乳动物细胞， 渗入压在 260－320mOsm/kg 的范畴都适宜。
四、pH 气体也是细胞保存的必须前提之一，所需气体丰如果氧和二氧化碳。氧 参与三羧酸轮回，产生能量赐与细胞生长、增殖和合成各类成分。一些细胞在缺 氧情状下，借糖酵解也可获取能量，但大都细胞缺氧不克不及保存。在开放培育提拔时， 一般置细胞于 95％空气加 5％二氧化碳的混合气体情况中培育提拔。 二氧化碳既是细 胞代谢产品，也是细胞所需成分，它次要与庇护培育提拔基的 pH 有间接关系。动物 细胞大大都需要略微的碱性前提，pH 值约在 7．2~7．4℃在细胞生长过程中，随 细胞数量的增加和代谢活动的加强，二氧化碳不竭被释放，培育提拔液变酸，PH 值 发作改变。因为 NaHCO3 随便合成为二氧化碳，很不不变，以致缓冲系统难以精 确地掌握。故那一缓冲系统合适密闭培育提拔。HEPES 连系碳酸氢钠利用，可供给更 有效的缓冲系统，次要是避免 pH 值敏捷变更，但更大缺点是在开放培育提拔或看察 时难以庇护一般的 pH 值。形成 pH 颠簸次要是代谢产生的 CO2 ，在封锁式培育提拔 过程中 CO2 与水连系产生碳酸，培育提拔基 pH 很快下降。为处理那一问题，合成培 养基中利用了 NaHCO3-CO2 缓冲系统，并摘用开放培育提拔，使细胞代谢产生的 CO2 及时溢出培育提拔瓶， 再通过不变调剂温箱中 CO2 浓度 （5％） 与培育提拔基中的 NaHCO3 ， 处于平衡形态。
五、 无毒、 无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物量没有对抗才能， 因而培育提拔基应到达无化学物量污染、无微生物污染（如细菌、实菌、收原体、病 毒等） 、无其他对细胞产生损伤感化的生物活性物量污染（如抗体、补体） 。关于 天然培育提拔基，污染次要来源于取材过程及生物素材自己，应当严厉选材，严厉操 做。关于合成培育提拔基，污染次要来源于配造过程，配造所用的水，器皿应非常洁 净，配造后应严厉过滤除菌。
第三节 天然细胞培育提拔基
天然培育提拔基是指来主动物体液或操纵组织别离提取的一类培育提拔基， 如血浆、 血清、 淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培育提拔手艺成立早期，体外培育提拔细胞都是操纵天然培 养基。但是因为天然培育提拔基造造过程复杂、批间差别大，因而逐步为合成培育提拔基 所替代。目前普遍利用的天然培育提拔基是血清，别的各类组织提取液、促进细胞贴 壁的胶原类物量在培育提拔某些特殊细胞也是必不成少。 血清(serum (serum)细胞培育提拔的开展，培育提拔基的量量又是关键，而培育提拔基的次要成
一、血清(serum 份中动物血清对细胞的生长繁育发扬着重要以至是难以替代的感化。 在动物血清 的利用中牛血清又是最为普遍的， 所以血清是医药生物手艺产物中重要的原素材 之一。包管血清量量也是促进生物成品行量进步的重要环节。
1、 血清品种:
目前用于组织培育提拔的血清次要是牛血清， 血清、马血清等。抉择用牛血清培育提拔细胞的原因：来源充沛、造备手艺成熟、经 过长时间的利用考验人们对其有比力深进的理解。 牛血清对绝大大都哺乳动物细 胞都是合适的，但其实不肃清在培育提拔某种细胞时利用其他动物血清更适宜。 牛血清是细胞培育提拔顶用量更大的天然培育提拔基， 含有丰富的细胞生长必需的营养成 份，具有极为重要的功用。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血 清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生 24 小时之内的重生牛；小牛血清取 自出生 10－30 天的小牛。显然，胎牛血清是操行更高的，因为胎牛还未接触外 界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分起码。 血清的次要成分:血清是由血浆往除纤维卵白而构成的一种很复杂的混合物。
2、血清的次要成分
其构成成份虽大部门已知，但还有一部门尚不清晰，且血清构成及含量常随供血 动物的性别、年龄、心理前提和营养前提差别而异。血清中含有各类血浆卵白、 多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，那些物量对促进细胞生 长或按捺生长活性是到达心理平衡的。 对血清的成分和感化的研究虽有很猛进展， 但仍存在一些问题。次要是： 第一:血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其感化机造 仍不清晰，出格是对此中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未足够熟悉，那 给研究工做带来许多困难； 第二:血清都是批量消费，各批量之间差别很大，并且血清保留期至多一年，因 此， 要包管每批血清的类似性极为困难， 从而使尝试的原则化和持续性遭到限造； 第三:不克不及肃清血清中含有易变物量，那被认为是“瓶中恶化”的原因之一。
3、血清次要感化：
供给根本营养物量：氨基酸、维生素、无机物、脂类物量、核酸衍生物等，是细 胞生长必需的物量。 供给激素和各类生长因子： 胰岛素、 肾上腺皮量激素 （氢化可的松、 地塞米松） 、 类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮 生长因子、血小板生长因子等。 供给连系卵白： 连系卵白感化是照顾重要地低分子量物量， 如白卵白照顾维生素、 脂肪、以及激素等，转铁卵白照顾铁。连系卵白在细胞代谢过程中起重要感化。 供给促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 对培育提拔中的细胞起到某些庇护感化：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞能够 释放卵白酶， 血清中含有抗卵白酶成分， 起到中和感化。 那种感化是偶尔发现的， 如今则有目标的利用血清来末行胰卵白酶的消化感化。 因为胰卵白酶已经被普遍 用于贴壁细胞的消化传代。血清卵白构成了血清的粘度，能够庇护细胞免受机械 损伤，特殊是在悬浮培育提拔搅拌时，粘度起到重要感化。血清还含有一些微量元素 和离子，他们在代谢解毒中起重要感化，如 SeO3,硒等。
4、细胞培育提拔中利用血清的缺点
血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，使血清有 几个明显的缺点： 对大大都细胞，在体内形态，血清不是它们接触的心理学液体，只是在损伤愈合 以及血液凝聚过程中才接触血清， 因而利用血清有可能改动某种细胞在体内的正 常形态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时按捺另一类细胞生长 （表皮细胞） 。 血清含一些对细胞产生毒性的物量，如多胺氧化酶，能与来自高度繁育细胞的多 胺反响（如精胺、亚精胺）构成有细胞毒性感化的聚精胺。补体、抗体、细菌毒 素等城市影响细胞生长，以至形成细胞灭亡。 动物个别差别， 血清产地、 批号差别， 每批量量差别甚大， 其成分不克不及连结一致。 取材中可能带进收原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能招致尝试失败或尝试 成果不成靠性。 血清的利用使得尝试和消费的原则化困难， 此中的卵白量使得某些转基因卵白生 物药品消费平分别纯化工做很难完成。 大规模消费中，血清来源越来越困难，价格高贵，是构成动物细胞培育提拔对消费成 本的次要部门之一。
5、血清的量量原则:
血清量量凹凸取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。用于取材的动物应安康无病而且在指定的出生天数之内，取材过程应严厉 根据操做规程施行，造备出的血清要颠末严厉的量量判定。WHO 公布的《用动物 细胞体外培育提拔消费生物成品规程》中的要求： 牛血清必需来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国度。 并应具备恰当的监测 系统。 有些国度还要求牛血清来自未用过反刍动物卵白饲料的牛群。 证明所用牛血清中不含对所消费疫苗病毒的按捺物。 血清要通过滤膜过滤除菌，包管无菌。 无细菌、霉菌、收原体和病毒的污染，有些国度要求无细菌噬菌体污染。 对细胞有优良的撑持繁育感化。 我国在对牛血清的量量 2000 年版《中国生物成品次要原辅料量控原则》中提出 比力严厉的原则要求。包罗卵白量含量，细菌、实菌、收原体、牛病毒、大肠杆 菌噬菌体、细菌内毒素，撑持细胞增殖查抄。 血清量量的判定一般包罗以下几个方面： 理化性量：如渗入压、pH 值、卵白电泳图谱、卵白含量、激素程度、内毒素等。 卵白含量包罗血清总卵白含量 （不低于 35-45g/L） 球卵白含量 、 （应小于 20g/L)、 血红卵白含量等。此中球卵白含量是一项十分重要的目标，血清中球卵白次要是 抗体，球卵白含量越低血清量量越高。血红卵白也是越低越好。 微生物检测： 包罗细菌、 实菌、 收原体、 病毒等。 特殊是对收原体、 病毒的检测， 收原体是一种很小的微生物，可通过孔径 22u 的滤膜。收原体、病毒污染在光学 显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁育，但会影响尝试成果。检测收原体的办法 良多，如培育提拔法、PCR 法、荧光染色法、电镜看察法等。 促生长效果： 那是血清重要的特征之一， 应当以培育提拔的细胞来检测。 有两种办法： 克隆构成率、贴瓶率测定法和持续传代培育提拔法。
(1) 克隆构成率测定：一般以悬浮生长的细胞为培育提拔对象，按有限稀释法做克隆
克隆构成率测定 化培育提拔，将差别批号的血清配造成差别浓度的培育提拔基，细胞也稀释成差别浓度， 接种到 96 孔板，每孔 200ul，培育提拔必然时间，统计有克隆生长的孔，计算出百 分比，再与比照的原则血清比拟较，就可看出差别批号血清间的区别。比力低的 浓度，更能看察出血清量量间的细微区别。
(2) 贴瓶率测定：是以贴壁细胞为培育提拔对象， 贴瓶率测定： 将细胞稀释至低密度， 接种至平皿，
贴瓶率测定： 每皿 200 或 100 个细胞，以差别浓度的血清培育提拔基培育提拔，培育提拔必然时间后弃培育提拔 基，染色后统计集落数，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与原则血 清比力，揣度血清量量凹凸。
(3) 持续传代培育提拔法：是将细胞培育提拔于 3 个必然体积的培育提拔瓶中，待测血清配造 为 5％浓度，一般于第七天搜集细胞，计数，取均匀值，中间能够改换一次培育提拔 基。持续测试三个周期以上，看察细胞生长情况，并将每次的计数成果与原则血 清的测试成果比力。 关于利用者，揣度血清量量先从外看进手。好的血清应该是通明清澈，土黄色或 棕黄色，无沉淀或少少沉淀，比力稀薄。如发现血清污浊、不通明、含许多沉淀 物，阐明血清污染或血清中的卵白量变性；若血清呈棕红色，阐明血清中的血红 卵白含量太高，取材时有溶血现象；假设扭捏时觉得液体稀薄，阐明血清中掺进 的心理盐水太多。假设要进一步领会血清的量量，则应持续培育提拔某些细胞，看察 细胞生长情况。 血清的利用与贮存:准确的利用及保留血清，才气使血清发扬应有的感化。
6、血清的利用与贮存
利用前处置：大部门血清在利用前必需灭活处置，即 56℃30 分钟。灭活的目标 是往除血清中的补体成分，制止补体对细胞产生毒性感化。血清颠末灭活也会损 失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因而也有人提出血清不经灭活间接用于 培育提拔，如许做的前提是确认血清中不含补体成分。关于一些操行高的胎牛血清和 新牛血清能够考虑不经灭活间接用于细胞培育提拔。 贮存前提： 血清一般贮存于－20℃， 同时应制止频频冻融。 购置大包拆的血清后， 起首要灭活处置，然后分拆成小包拆，贮存于－20℃，利用前熔化。熔化时更好 现置于 4℃。熔化后的血清在 4℃不宜长时间存放，应尽快利用。 利用浓度：自从有了合成培育提拔基，血清就是做为一种添加成分与合成培育提拔基混合 利用，利用浓度一般为 5－20％，最常用是 10％。过多血清随便使培育提拔中的细胞 发作改变，特殊是一些二倍体的无限细胞系，敏捷生长之后随便发作恶性转化。 摘购血清时，更好先从赐与商处索取样品停止试验，选定一批后就要保留足够使 用 6 个月至 1 年的量，曲至用另一批颠末预先试验的样品取代。
二、胚胎浸出液 胚胎浸出液(embryonic extract)是早期动物细胞培育提拔中利用的天然培育提拔基，现 已很少利用。
三、水解乳卵白 水解乳卵白(lactalbumin hydrolysate)为乳白卵白经卵白酶和 肽酶水解的产品，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培育提拔基，可用于许多细胞和 原代细胞的培育提拔。
第四节 合成细胞培育提拔基
合成培育提拔基是根据天然培育提拔基的成分，用化学物量模仿合成、人工设想、配造的 培育提拔基。它有必然的配方，是一种抱负的培育提拔基。目前合成培育提拔基多达 10 余外 种，有的培育提拔基仍在不竭停止改进。早期组织培育提拔是操纵天然培育提拔基，目前合成 培育提拔基已经成为一种原则化的商品，从最后的根本培育提拔基开展到无血清培育提拔基、 无卵白培育提拔基，而且还在不竭开展。合成培育提拔基的呈现极大的促进了组织培育提拔技 术的普及开展。
一、根本组分
根本培育提拔基包罗四大类物量：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化 合物。 无机盐：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调剂细胞渗入压、某些酶 的活性及溶液的酸碱度都是必需的。 氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸 (L 型)。它们都是细胞用以合成卵白量的必须原料，不克不及由其他氨基酸或糖类转 化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的感化， 对细胞的培育提拔特殊重要，能促进各类氨基酸进进细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌 呤和嘧啶的来源，仍是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甜和三磷酸腺苷的原料。细胞 需要谷氨酰胺合成核酸和卵白量，谷氨酰胺欠缺可招致细胞生长不良以至灭亡。 在配造各类培育提拔液中都应补加必然量的谷氨酰胺。值得重视的是：谷氨酰胺在溶 液中很不不变，故 4℃下放置 1 周可合成 50%，利用中更好零丁配造，置-20℃冰 箱中保留，用前加进培育提拔液中。 维生素：是庇护细胞生长的一种生物活性物量，在细胞中大多构成酶的辅基或辅 酶，对细胞代谢有严重影响。脂溶性维生素(A、D、E、K)常从血清中得到填补。 水溶性维生素包罗牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和 B12。维生素 C 也是不成贫乏的，对具有合成胶原才能的细胞更为重要。
碳水化合物：是细胞生命的能量来源，有的是合成卵白量和核酸的成分。次要有 葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培育提拔动物细胞时，几乎所有培育提拔基 或培育提拔液中都以葡萄糖做为必含的能源物量。 葡萄糖和谷胺酰胺的合理利用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的产品。研究表白，体 外培育提拔前提下 95％的葡萄糖改变为乳酸，那降低了营养物量的代谢效率，降低 培育提拔基 pH 值，增加渗入压。在氧气赐与不敷的情状下，NADH 转运系统苹果酸－ 天冬氨酸穿越系统活性低而不克不及将糖酵解产生的 NADH 氧化磷酸化为 NAD+，细胞 只得以降低能量需求的体例如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与 NADH 反 应消费乳酸和 NAD+，从而包管了糖酵解的顺利停止。另一个可能的阐明是毗连 糖酵解与 TCA 轮回的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、 磷酸丙酮酸羧化酶激酶和 丙酮酸羧化酶活性低下，间接招致糖酵解与 TCA 轮回的失衡。因而体外培育提拔前提 下，葡萄糖次要经糖酵解降解，产生过量的乳酸。削减乳酸消费最常用的办法是 限造培育提拔基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量过低可形成细胞营养赐与不敷，细胞 生长按捺。该办法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的消费速度以及目标卵白的 表达量等参数停止综合考虑方可利用。 在目前常用的培育提拔基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培育提拔动物细胞的次要能源，其 能量代谢通路与体内完全差别， 表示为葡萄糖次要经糖酵解路子为细胞供给能量， 谷胺酰胺大部门通过不完全氧化路子，另一小部门通过完全氧化为细胞供能。因 此，恰当的调整细胞内的代谢路子，使之能促进细胞的快速生长和产品合成，同 时削减代谢按捺物的生成是行之有效的一种战略。 许多动物细胞如 CHO、BHK 和杂交瘤细胞对营养物量葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利 用很快。然而关于细胞生长而言，二者的快速操纵并不是细胞必须；相反相当一部 分转化为代谢废料乳酸和氨，以及一些非必须氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。此中， 乳酸和氨是两种次要代谢废料，其积存可影响细胞生长以及产物行量。削减那两 种代谢产品的积存，是大规模细胞培育提拔手艺研究的重要标的目的。 氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。 限造培育提拔基中谷氨酰胺的含量亦是削减氨生 成的常用办法。 除了以上与细胞生长有关的物量以外，培育提拔基中一般还要加进酚红（当溶液酸性 时 pH 小于 6.8 呈黄色；当溶液碱性时 pH 大于 8.4 呈红色） ，一种 pH 指示剂。 在较为复杂的培育提拔液中还包罗核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化复原剂 (如谷胱甜肽)等。有的培育提拔液还间接摘用了三磷酸腺苷和辅酶 A。
二、常用细胞培育提拔基
(1)MEM 细胞培育提拔基系列
(2)DMEM 细胞培育提拔基系列
(3)RPMI-1640 细胞培育提拔基系列
(4)199 细胞培育提拔基系列
(5)水解乳卵白细胞培育提拔基
(6)欧氏平衡盐
(7)F-10,F-12 细胞培育提拔基系列
(8)其它类型细胞培育提拔基
三、干粉培育提拔基的配造
配造培育提拔基要重视以下问题： 认实阅读阐明书。阐明书都说明干粉不包罗的成分，常见的有 NaHCO3、谷氨酰 胺、丙酮酸钠、HEPES 等。那些成分有些是必需添加的，如 NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据尝试需要决定。 配造是要包管足够化解，NaHCO3、谷氨酰胺等物量都要等培育提拔基完全化解之后才 能添加。 配造所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 所用器皿应严厉消毒。 配造好的培育提拔基应立即过滤，无菌保留于 4 度。 液体培育提拔基次要是为了科研工做的便利而设想的培育提拔基， 它是一种灭菌后包管无 菌的溶液，需要时可造成无内毒素等的溶液，可节约科研人员的工做量。 配造办法 在一个尽可能接近总体积的容器中加进比预期培育提拔基总体积少 5％的双蒸水。 在室温（20℃到 30℃）的水中加进干粉培育提拔基，悄悄搅拌，不要加热。 水洗包拆袋的内部，转移全数的痕量干粉到容器内。 加 NaHCO3 到培育提拔基中。 用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌化解。重视不要过火搅拌。 通过迟缓搅拌加进 1N NaOH 或 1N HCL 调剂 pH 值， 因为 pH 值在过滤时会上升 0.1 到 0.3，因而调剂 pH 值使它比最末想要的 pH 值低 0.2 到 0.3。培育提拔基在过滤前 要连结密封。
第五节 无血清手艺及其培育提拔基
履历了天然培育提拔基、合成培育提拔基后，无血清培育提拔基和无血清培育提拔成为当今细胞培 养范畴的一大趋向。摘用无血清培育提拔可降低消费成本，简化别离纯化步调，制止 病毒污染形成的危害。 无血清培育提拔基(serum medium,SFM):是不需要添加血清就能够庇护细胞在 无血清培育提拔基(serum free medium,SFM): 体外较长时间生长繁育的合成培育提拔基。 但是它们可能包罗个别卵白或大量卵白组 分。 固然根底培育提拔基加少量血清所配造的完全培育提拔基能够称心大部门细胞培育提拔的 要求，但对有些尝试却不合适，如看察一种生长因子对某种细胞的感化，那时需 要肃清其他生长因子的骚乱感化。而血清中可能含有各类生长因子；又如需要测 定某种细胞在培育提拔过程平分泌某种物量（抗体、生长因子）的才能；或者要大规 模的培育提拔某种细胞，以获得它们的排泄产品。因而研造出无血清培育提拔基不断是生 物科学工做者勤奋的目标。 上海恒利安生物科技有限公司已胜利开发了贸易化的 多种无血清培育提拔基，可称心浩瀚厂商的需求。 无血清培育提拔基的根本配方:根本成分为根底培育提拔基及添加组分两大部门。
一、无血清培育提拔基的根本配方
用于生物造药和疫苗消费的细胞在体外培育提拔时， 大都呈贴壁生长或兼性贴壁生长； 而当其在无血清、无卵白培育提拔基中生长时，因为欠缺血清中的各类粘附贴壁因子 如纤粘连卵白、层粘连卵白、胶原、玻表粘连卵白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分包罗以下几大类物量：
(1）促贴壁物量：许多细胞必需贴壁才气生长，那种情状下无血清培育提拔基中必然 要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基量，如纤连卵白、层粘连卵白等。它 们仍是重要的团结素以及庇护一般细胞功用的分化因子， 对许多细胞的繁育和分 化，起着重要感化。纤连卵白次要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，那些细胞 包罗成纤维细胞、 肉瘤细胞、 粒细胞、 肾上皮细胞、 肾上腺皮量细胞、 CHO 细胞、 成肌细胞等。
(2）促生长因子及激素：针对差别细胞添加差别的生长因子。激素也是刺激细胞 生长、庇护细胞功用的重要物量，有些激素是许多细胞必不成少的，如胰岛素。
(3）酶按捺剂：培育提拔贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培育提拔基中 必不成少须含酶按捺剂，以末行酶的消化感化，到达庇护细胞的目标。最常用的 是大豆胰酶；按捺剂。
(4）连系卵白和转运卵白：常见如转铁卵白和牛血清白卵白。牛血清白卵白的添 加比力大，可增加培育提拔基的粘度，庇护细胞免受机械损伤。许多扭转式培育提拔的无 血清培育提拔基都含有牛血清白卵白。
(5) 微量元素： 硒是最常见的。
二、利用办法:
目前，血清仍是动物细胞培育提拔中最根本的的添加物，出格是在原 代培育提拔或者细胞生长情况不良时，经常会先利用有血清的培育提拔液停止培育提拔，待细 胞生长兴旺以后，再换成无血清培育提拔液。细胞转进无血清培育提拔基培育提拔要有一个适 应过程， 一般要逐渐降低血清浓度， 10%削减到 5%， 1%， 从 3%， 曲至无血清培育提拔。 在降低过程中要重视看察细胞形态能否发作改变，能否有部门细胞灭亡，存活细 胞能否还连结原有的功用和生物学特征等。 在尝试后那些细胞一般不再陆续保留， 很少有细胞可以持久培育提拔于无血清培育提拔基而不发作改动的。 细胞转进无血清培育提拔 之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培育提拔于含血清的培育提拔基中，以包管细胞 的特征不发作改变。 为了使细胞适应无血清培育提拔，关键的是使所培育提拔细胞： 处于对数生长中期 90% 活细胞率 适应时以较高的起始细胞接种 有两种办法使细胞适应无血清培育提拔基（SFM）: 间接适应——细胞从添加血清的培育提拔基转换到无血清培育提拔基（SFM）中。
1、间接适应 一些类型细胞可间接从包罗血清的培育提拔基适应无血清培育提拔基。关于间接适应，接 种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105 细胞/ml。当细胞密度到达 1×106~3×106 细胞/ml 时，传代培育提拔细胞。当细胞密度在培育提拔 4 到 7 天后到达 2×106~4×106 细胞/ml 时，细胞完全适应了无血清培育提拔基。每隔 3~5 天，当细胞密度到达 1×106~3×106 细胞/ml，细胞活率在 90％时，贮备的适应了无血清培育提拔基的细 胞培育提拔物应该再次传代培育提拔。 持续适应— （SFM）
2、 持续适应——分好几步把细胞从添加血清的培育提拔基转换到无血清培育提拔基 中，与间接适应比拟较，持续适应趋势关于细胞愈加温暖一些。 以 2 倍一般接种密度接种生长活泼的细胞培育提拔物到 75%有血清培育提拔基：25％SFM 混合培育提拔基中，传代培育提拔。 当细胞密度5×105 细胞/ml 时，以 2×105 到 3×105 细胞/ml 细胞密度，在有 血清培育提拔基：SFM 为 50∶50 的混合培育提拔基中传代培育提拔。 以 2×106 到 3×106 细胞/ml 细胞密度，25％有血清培育提拔基和 75% SFM 中传代培 养。 当细胞密度到达 1×106 到 3×106 细胞/ml（接种后 4 到 6 天） ，在 100％SFM 培 养基中传代培育提拔。 每隔 3 到 5 天， 当细胞密度到达 1×106 到 3×106 细胞/ml， 细胞活率在 90％时， 贮备的适应了无血清培育提拔基的细胞培育提拔物应该再次传代培育提拔。 定见备份前一次混合培育提拔的培育提拔物，曲到每一次细胞适应了新的混合培育提拔基。每 一次削减血清前，可能需要在 SFM/有血清混合培育提拔基中停止几次传代。 在适应过程中，更好不要让细胞生长过度。那将增加抉择亚群的可能性。需要注 意，与有血清培育提拔基比拟，大部门 SFM 包罗十分少的卵白量，因而更易于受外界因素的影响。 细胞培育提拔适应替代血清：许多细胞操纵持续适应办法能很好的适应，用包罗 FBS 的的培育提拔基和包罗有替代血清的培育提拔基 1∶1（v∶v）的混合培育提拔基培育提拔细胞。 通过下列的混合培育提拔基的体例， 持续几代削减当前培育提拔基的量： 1∶2， 1∶4， 1∶ 16 和 100％替代培育提拔基。每次适应改动血清比例时，传代细胞 2 到 3 次。 培育提拔能够间接从 FBS 转换到替代血清。 一起头就利用不异于 FBS 的浓度的替代物 或血清，生长的延迟可能会发作，容许停止 2 到 3 次的传代，使生长率恢复到 以前的程度。 特殊需要强调的是：配造无血清培育提拔液必需利用高量量的水，如石英玻璃蒸馏器 经三次蒸馏或超纯水净扮装置造备的水。 因为无血清培育提拔基欠缺了血清中天然成 分中和毒素、庇护细胞的大分子，既便水中的有毒物量含量甚微，也可能对细胞 产生致死性损害。那是无血清培育提拔能否胜利的关键因素之一。
三、利用无血清培育提拔基的长处 增加确定性 性能愈加一致 随便停止纯化和下流加工 细胞功用的切确评估 加强生长和/或产量 心理反响性的较好比照 加强细胞内中介物的检测。
第六节 无卵白培育提拔基与限制化学成分培育提拔基
midium,PFM） ：即不含有动物卵白的培育提拔基。
一、无卵白培育提拔基（protein free midium,PFM） 无卵白培育提拔基（ ： 无血清培育提拔基仍含有较多的动物卵白，如胰岛素，转铁卵白、牛血清白卵白等。 从生物手艺开展的趋向来看，不含动物卵白的培育提拔基又普遍的利用前景，许多利 用基因工程手艺重组的卵白量最末要利用于人体， 假设再生长过程中利用了含有 动物卵白量的培育提拔基，纯化过程就比力复杂，最末要到达必然的量量原则也有一 定的难度。无卵白培育提拔基就是为了适应那开展趋向而呈现的，许多无卵白培育提拔基 添加了动物水解物以替代动物激素、生长因子的感化。市场上已有合适多种细胞 生长的无卵白培育提拔基。 限制化学成分培育提拔基(chemical medium,CDM)：
二、限制化学成分培育提拔基(chemical defined medium,CDM)：是指培育提拔基中的素 有成分都是明白的，它同样不含有动物卵白，同样也不是添加了动物水解物，而 是利用了一些已知构造与功用的小分子化合物，如短肽、动物激素等。那种培育提拔 基更有利于阐发细胞的排泄产品。目前已经有合适于 293 细胞、CHO 细胞、杂交 瘤细胞生长的 CDM 问世， 上海恒利安生物科技有限公司消费的水解乳卵白培育提拔基 就属于 CDM。
第七节 其他细胞培育提拔用液
在细胞培育提拔过程中，除了培育提拔基外，还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH 调整液等。 平衡盐溶液（ solution,BSS） ：次要是由无机盐、葡萄糖组
一、平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS） ： 它的感化是庇护细胞渗入压平衡，连结 pH 不变及供给简单的营养。次要用 于取材时组织块的漂洗、 细胞的漂洗、 配造其他试剂等。 最简单的 BSS 是 Ringer。 D-Hank's 与 Hank's 的一个次要区别是前者不含有 Ca2+、Mg2+，因而 D-Hank's常用于配造胰酶溶液。Earle 平衡液含有较高的 NaHCO3(2.2g/L),合适于 5%CO2 的培育提拔前提，Hank's 平衡液仅含有 0.35g/L NaHCO3，不克不及用于 5%CO2 的情况， 若放进 CO2 培育提拔相，溶液将敏捷变酸，利用时应重视。 配造溶液应利用双蒸水或往离子水。假设配方中含有 Ca2+、Mg2+，应当起首溶 解那些成分。配好的平衡盐溶液能够过滤除菌或高温灭菌。
二、消化液：取材停止原代培育提拔时经常需要将组织块消化解离构成细胞悬液，传 代培育提拔时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来， 常用的消化液有胰酶 （Trypsin） 溶液和 EDTA 溶液，有时也用胶原酶（collagenase）溶液。
1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪卵白的才能表达，常见有 1：125 和 1：250， 即一份胰酶可消化 125 或 250 份酪卵白。组织培育提拔用胰酶溶液一班配造成 0.1-0.25%浓度，配造时要用不含 Ca2+ 、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如前面的 D-Hank's） ，因为那些物量会对胰酶产生按捺造用。胰酶感化及化解的更佳 pH 是 8-9，配造胰酶溶液应将液体调至 pH8 摆布，足够化解，过滤除菌。过滤后可 以再调只 pH7.5，也可不调。 利用细胞清洗液配造胰酶消化液：含 0.5%胰酶的细胞清洗液（100ml 细胞清洗液 加 0.5g 胰酶） ，过滤除菌，分拆于 4 度保留。 溶液： EDTA 溶液也常用来解离细胞， 它的感化机造是毁坏细胞间的毗连。
2、 EDTA 溶液： 关于一些贴壁特殊安稳的细胞，还能够用 EDTA 和胰酶的混合液停止消化。EDTA 溶液的利用浓度为 0.02%，配造时应加碱助溶，配造后可过滤除菌，也可高温消 毒灭菌。
3、胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培育提拔时经常利用，胶原酶感化的对象 是胶原组织，因而不随便对细胞产生损伤。胶原酶的利用浓度为 0.1-0.3mg/L 或 200000U/L,感化的更佳 pH 为 6.5。胶原酶不受 Ca2+ 、Mg2+及血清的按捺， 配造时可用 PBS。
三、pH 调整液:常用的有 HEPES 液和 NaHCO3 溶液。
1、NaHCO3 溶液：NaHCO3 是培育提拔基中必需添加的成分，一般情状下按阐明书的要 求准确添加，以包管培育提拔基在 5%CO2 的情况下 pH 到达设想原则。假设是封锁式 培育提拔，即不与 5%CO2 的情况发作交换到达平衡，所利用的培育提拔基就不克不及根据阐明 书所要求加进 NaHCO3。此时常用 5.6%或 7.4%的 NaHCO3 溶液调剂培育提拔基，使之 到达所要求的 pH 情况。
2、HEPES 溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性， 次要感化是避免培育提拔基 pH 敏捷变更。在开放式培育提拔前提下，看察细胞时培育提拔基 离开了 5%CO2 的情况，CO2 气体敏捷逸出，pH 敏捷升高，若加了 HEPES，此时可 以庇护 pH7.0 摆布。一般在停止克隆化培育提拔时要添加 HEPES。
四、抗生素:常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素次要是对革兰阳性 菌有效，链霉素次要对革兰阴性菌有效。加进那两种抗生素可预防绝大大都细菌 污染。 凡是利用青霉素末浓度 0.007-0.008g/100ml,链霉素末浓度 0.01g/100ml。 一班配造成 100 倍浓缩液，可用 PBS 或培育提拔基配造。 谷氨酰胺填补液:
五、谷氨酰胺填补液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要感化，合成培育提拔基中都 要添加，因为谷氨酰胺在溶液中很不不变随便降解，4℃下放置 7 天即可合成约 50%，所以都是在利用前添加。配造好的培育提拔液（含谷氨酰胺）在 4℃放置 2 周 以上时，要从头加进本来量的谷氨酰胺，故需零丁配造谷氨酰胺，以便暂时加进 培育提拔液内。谷氨酰胺利用末浓度为 0.002mol/L。一班配造为 100 倍浓缩液，即 浓度为 200mmol/L（29.22g/L） ，配造时应加温 30℃，完全化解后过滤除菌，分拆至小瓶，贮存于－20℃。利用时，在每 100ml 培育提拔液中加进 0.5~2ml 谷氨酰胺 浓缩液，末浓度为 1~4mmol/L。
二肽谷氨酰胺（ 丙氨酰- 谷氨酰胺）
六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺） 在细胞培育提拔液中 L-谷氨酰胺是大部门细胞培育提拔基的根本成分；而 L-谷氨酰胺是 一种其实不不变的氨基酸，在中性的水溶液中会自觉降解；需要频繁地补加 L-谷 氨酰胺。因而在培育提拔操做过程中经常：
（1）频繁翻开盖子，增加了毁坏无菌形态的可能性；
（2）过多的逃加 L-谷氨酰胺，增加了培育提拔基中氨的毒性程度。 二肽谷氨酰胺在细胞培育提拔中不变而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨起码! 二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，产生 L-谷氨酰胺和 L-丙氨酸；因而在大部门细胞系统中二肽谷氨酰胺就能够象 L-谷氨酰胺同样有 效地被操纵。 二肽谷氨酰胺是更优替代物， 它无需适应； 既可用于贴壁细胞培育提拔， 也合适于悬浮细胞的培育提拔。